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最新引進(jìn)細(xì)胞:小鼠前列腺癌上皮細(xì)胞Tramp-C1

發(fā)布時(shí)間:2024/11/19 9:25:21      閱讀次數(shù):25

 

傳代方法

第一次建議1:2傳代 

凍存條件

細(xì)胞庫無血清凍存液

細(xì)胞描述

織來源:前列腺

疾。合侔

性別:雄性

年齡:32周

培養(yǎng)體系:該細(xì)胞系培養(yǎng)所用基本培養(yǎng)基為 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM),配置完全培養(yǎng)基時(shí)需加入 5ug/ML bovine insulin,10 nM dehydroisoandrosterone,10%FBS, 1%Anti-Anti.

本庫的細(xì)胞僅用于科研工作,未經(jīng)許可不得用于其他目的,使用者不得將本庫細(xì)胞轉(zhuǎn)讓給第三者.

培養(yǎng)備注

該細(xì)胞系培養(yǎng)所用基本培養(yǎng)基為高糖DMEM, 配置完全培養(yǎng)基時(shí)需加入 10%FBS,10ug/ml Insulin,1% Anti-Anti

細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法.收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞,消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,將細(xì)胞瓶放入37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理.顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存(最好40x,100x,200x各一張),前三天照片重要售后依據(jù),不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好.換液后將瓶蓋擰松

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

a 細(xì)胞傳代如果未超過80%匯合度時(shí),將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng);如果細(xì)胞密度80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng).

貼壁細(xì)胞傳代步驟如下:

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次.

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化.

3.輕輕吹打細(xì)胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)重懸.

4. 將細(xì)胞懸液按1:2的比例進(jìn)行分瓶傳代(兩個(gè)T25瓶),補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

懸浮細(xì)胞傳代步驟日下:

1 半換液法

半換液處理,豎著培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱靜置1小時(shí)左右,輕輕吸掉3ml左右培養(yǎng)基,然后補(bǔ)給3ml的完全培養(yǎng)基,如果培養(yǎng)基變色慢,可直接加500ul左右FBS,傳代的時(shí)候可以直接補(bǔ)給5ml培養(yǎng)基  分兩個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng),一般這樣傳代3次左右可以離心傳代一次,去掉死細(xì)胞.

2 離心換液法

如需分瓶可以將細(xì)胞懸液收集到離心管中1000rpm,離心5min,棄去上清,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行.

b 細(xì)胞凍存:

1 細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次;

2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min;

3 棄上清,沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液(貨號(hào):C7001),混勻后加入凍存管中.

4 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,需在-80℃冰箱 存放24小時(shí)以上轉(zhuǎn)入液氮罐中.

C 細(xì)胞復(fù)蘇:

1 從液氮中取出細(xì)胞凍存管(注意佩戴防護(hù)面具),快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁;

2 將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min;

3 棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種T25培養(yǎng)瓶,37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

4 第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

注意事項(xiàng):有些細(xì)胞貼壁不牢,在運(yùn)輸過程中容易發(fā)生細(xì)胞脫落,這是正,F(xiàn)象.如脫離較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)(后期對(duì)比培養(yǎng)),沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng).再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸.然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代(兩個(gè)T25),補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).


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