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人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥株(ASPC-1/GEM)

發(fā)布時(shí)間:2024/7/1 9:44:15      閱讀次數(shù):339

 人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥株ASPC-1/GEM                             

細(xì)胞介紹

一個(gè)胰腺癌病人的腹水中的細(xì)胞移植到裸鼠后建立了這個(gè)細(xì)胞株.

細(xì)胞特性

1) 來(lái)源ASPC-1耐藥篩選

2) 形態(tài):上皮細(xì)胞樣,貼壁生長(zhǎng)

3) 含量:>1×106  細(xì)胞數(shù)             

4) 用途:僅供科研使用

細(xì)胞運(yùn)輸 保存及注意事項(xiàng)

 

復(fù)蘇細(xì)胞

凍存細(xì)胞

包裝

充液的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

1mL凍存管

運(yùn)輸條件

常溫

干冰

保存方式

75%酒精消毒瓶壁,置于37恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱

-80℃冰箱中保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮/立即復(fù)蘇

注意事項(xiàng)

1. 收到細(xì)胞請(qǐng)先就培養(yǎng)瓶/凍存管的外觀 細(xì)胞的狀態(tài),進(jìn)行拍照并保存,如有問(wèn)題請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們;

2. 收到的復(fù)蘇細(xì)胞,若有較多細(xì)胞飄起,可能由于運(yùn)輸導(dǎo)致.請(qǐng)先置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2~4h,待細(xì)胞貼壁后再做處理;

3. 復(fù)蘇細(xì)胞充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基,收到細(xì)胞后請(qǐng)及時(shí)更換為完全培養(yǎng)基;

4. 建議收到細(xì)胞后,首先進(jìn)行擴(kuò)增,并凍存部分細(xì)胞以備用.

細(xì)胞耐藥誘導(dǎo)過(guò)程

待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后,開(kāi)始倍增藥物誘導(dǎo)劑量,每個(gè)劑量保持至細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)至匯合度達(dá)50%以上.遞增藥物濃度依次為:0.03μg/mL 0.3μg/mL 1.5μg/mL 3μg/mL 6μg/mL 12μg/mL 18μg/mL.約10個(gè)月后,細(xì)胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng),視為耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功,并命名為ASPC-1/GEM.

細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制

1)GEM藥物的配制及保存

建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液:即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物,使其完全溶解.

注意:可根據(jù)用量配置藥物,并將藥物分裝保存,避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效.溶解后的GEM,4℃保存1周,-20℃保存1個(gè)月,-80℃保存6個(gè)月.

2)凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配.

3)完全培養(yǎng)基的配制(推薦使用h005-001b

成分

體積/濃度

優(yōu)質(zhì)胎牛血清

10%

雙抗

1%

GlutaMAX-1谷氨酰胺

1%

GEM

0~18μg/mL

DMEM培養(yǎng)基

補(bǔ)充至所需體積

細(xì)胞培養(yǎng)條件

氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%;溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%~80%.

細(xì)胞處理

1凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,1000rpm/min離心3~5min,棄去上清液.加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,均勻鋪于6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(或皿)中,置于37恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng).第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,2~3day換液.

注意:細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中,不可使用含有藥物的培養(yǎng)基.須在細(xì)胞完全貼壁,形態(tài)完全展開(kāi),生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后,方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加GEM藥物.加藥后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢,可適當(dāng)降低GEM的濃度,或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí),再更換為所需的GEM濃度;

②建議復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)始終穿戴防護(hù)手套和面罩,避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸,造成人員傷害.

2)細(xì)胞傳代(建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照12比例傳代)

細(xì)胞密度達(dá)80%~90%時(shí),可進(jìn)行傳代培養(yǎng).

棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1,吸凈殘余的PBS.

加入適當(dāng)體積的0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA培養(yǎng)瓶中T25-1mL,其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可,置于37培養(yǎng)箱中消化2~5min,顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落,即可輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落.迅速拿回操作臺(tái),加入2倍體積的 10%FBS的培養(yǎng)基中止消化. 

將細(xì)胞懸液移入離心管中,1000rpm/min離心5min,棄去上清液.

⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,輕吹混勻.將細(xì)胞懸液按11的比例均勻鋪于2個(gè)的培養(yǎng)/中,添加6~8mL完全培養(yǎng)基,置于37恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,2~3day換液.

注意:細(xì)胞傳代過(guò)程中,不可使用含有藥物的培養(yǎng)基.須在細(xì)胞完全貼壁,形態(tài)完全展開(kāi),生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后,方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加GEM藥物.加藥后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢,可適當(dāng)降低GEM的濃度,或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí),再更換為所需的GEM濃度.

3)細(xì)胞凍存

細(xì)胞凍存時(shí),步驟同2)細(xì)胞傳代的~④,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,加入配制好的細(xì)胞凍存液,重懸細(xì)胞,1×106 ~ 1×107個(gè)細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中,標(biāo)注好名稱 代數(shù) 日期等信息.

將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,-80冰箱中過(guò)夜,之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存.同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用.


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